Svrha provođenja molekularno-genetičkih metoda istraživanja je utvrditi prisutnost modifikacija i promjena u nekim kromosomima, regijama DNA ili genima. Ova metoda rada s DNK bila je široko korištena u praksi 1970-ih - 1980-ih. prošlog stoljeća.
Kada se radi o molekularno genetskim istraživanjima
Molekularne genetičke studije pomažu u dijagnosticiranju:
- Monogene genetske bolesti;
- Vjerojatnost razvoja onkoloških bolesti;
- Prisutnost čimbenika koji izazivaju multifaktorijske bolesti.
Utvrđivanje rizika razvoja onkoloških procesa pomoću molekularno-genetičkih istraživanja:
- Rizik od razvoja raka želuca i štitnjače;
- Vjerojatnost raka debelog crijeva i ranih stadija ove bolesti;
- Genetska predispozicija za razvoj raka tijela maternice, jajnika, mliječnih i prostatnih žlijezda;
- Prisutnost rekombinacije gena ABL / BCR otkrivenih u leukemiji;
- Prisutnost preduvjeta koji osiguravaju učinkovitost antitumorske terapije gefatinibom u prisutnosti karcinoma koji nije mali .
Provedbom molekularno-genetičkih testova na prisutnost genetski određenih preduvjeta za razvoj multifaktorskih bolesti moguće je identificirati rizik razvoja:
- hipertenzivna bolest;
- preeklampsija;
- reumatoidni artritis;
- osteoporoza;
- poremećaji metabolizma lipida;
- dijabetes melitus tip 1 i 2;
- bolesti reproduktivnog sustava.
Ovom metodom procjenjuju se metabolizam i valjanost uporabe određenih lijekova..
Kome su propisane molekularno genetske studije
Pokazano je molekularnim genetskim testovima pojedincima:
- koje boluje od neplodnosti;
- izloženi nepovoljnim čimbenicima okoliša;
- u obitelji imaju bliske srodnike koji boluju od onkoloških, mentalnih, vaskularnih i endokrinih bolesti.
Kako je molekularni genetički test
Prva faza molekularno genetske analize je vrlo važna i sastoji se u dobivanju uzoraka RNA i DNA, koji su pojedinačni fragmenti stanične DNK ili njezinog cijelog lanca. Za izoliranje potrebnog broja fragmenata koristi se metoda amplifikacije, tj. Njihova reprodukcija lančanom reakcijom polimeraze (enzimska replikacija)..
Analiza molekula DNA zahtijeva njihovu preliminarnu podjelu na dijelove i liječenje bakterijskim endonukleazama (restrikcijama) - enzimima koji mogu smanjiti dvostruku spiralu DNA u 4-6 parova..
DNA fragmenti su razdvojeni po duljini i veličini pomoću posebnog gela (poliakrilamid i agaroza), korištenjem elektroforeze. Pod djelovanjem potonjeg, oni se kreću niz gel s različitim brzinama, ostavljajući iza sebe diskretnu traku..
Molekularne genetičke studije nasljednih patologija također se koriste za proučavanje ljudskog genoma. Southern blot hibridizacija omogućuje da se u ovom slučaju odrede specifični fragmenti DNA potrebni za to. Istodobno, prvo se pribjegava denaturaciji DNK, zbog čega se fragmenti dobivaju u obliku jednog lanca i prenose u filtar (najlon ili nitroceluloza), koji je namočen u pufersku otopinu..
Gel, na kojem se nalaze fragmenti DNA, se prenese na filter papir sa slanom otopinom (s visokom koncentracijom%). Nitrocelulozni filter i filtriranje, ali suhi papir (za apsorpciju slane otopine) stavljaju se na vrh. Kao rezultat, jednolančana DNA ostaje na filteru u istom položaju kao i na gelu..
Da bi se identificirali potrebni fragmenti, provodi se postupak hibridizacije DNA sa svojim kloniranim fragmentom ili radioaktivnom DNA sondom. Rezultat ovog postupka detektira se radioautografijom, zbog čega se sve komplementarne sonde DNA sekvence reflektiraju u obliku radioaktivnog pojasa..
Južna metoda dopušta ponovno stvaranje restrikcijske karte ljudskog genoma u određenom dijelu gena. To omogućuje otkrivanje prisutnosti bilo kakvih defekata u samom genu. Razvijene metode smatraju se vrlo djelotvornima i omogućuju najprecizniju dijagnozu nasljednih bolesti. U tu svrhu, DNA je ekstrahirana iz embrionalnih stanica koje se nalaze u amnionskoj tekućini. Zatim se hibridizira korištenjem Southern blot s radioaktivnom DNA sondom. Kao rezultat toga, vrlo je lako prepoznati abnormalni embion, jer njegova DNA hibridizira isključivo s DNA sondom koja je komplementarna s mutantnim slijedom..
Moderna znanost koristi brojne metode za identifikaciju mutacija. Svi su podijeljeni na indirektne i izravne metode molekularnog genetskog istraživanja..
Indirektne metode otkrivanja mutacija koriste se ako je pozicija gena na genetskoj karti poznata, ali se nukleotidna sekvenca ne dešifrira..
Izravna dijagnoza može biti nekoliko vrsta:
- sekvencioniranje. To je tehnika za identifikaciju nukleotidne sekvence da se odredi zamjena baza u određenom fragmentu..
- Blot hibridizacija, ali južna. To je restrikcijska analiza, pomoću koje pronalaze mutacije koje imaju kršenje mjesta restimacije..
- Alelospecifična hibridizacija sa sintetičkom sondom. Ova metoda također omogućuje otkrivanje mutacija u genomskoj DNA..
- Elektroforeza dvolančane DNA u gelu (ravnomjerno denaturiranje, neutralno). To je cijepanje DNA na kemijskoj i enzimatskoj razini. Na mjestima gdje su baze pogrešno ušivene, obično se definira skupina mutacija..
- Proučavanje elektroforetske pokretljivosti DNA mutantnih molekula.
- Analiza sintetiziranog proteina pomoću elektroforeze. Prisutnost mutacija procjenjuje se promjenom mobilnosti proteina u in vitro sustavu.
Mutacije se također dijagnosticiraju pomoću definicije polimorfnih fragmenata (restrikcijska duljina) u genomu. U tu svrhu koristi se isti postupak Southern blot hibridizacije..
Među ostalim vrstama polimorfizma DNA, također se razlikuju mikrosateliti. To su kratke sekvence DNA (tandemski ponavljajuće mono-, di-, tri- i tetranukleotid). Oni služe kao markeri defektnih mutacija ili markerskih lokusa alelnih varijanti gena u studiji..
Gen koji je odgovoran za razvoj Huntingtonove koreje, teške patologije, otkriven je 1993. godine. Uz ovu bolest dolazi do smanjenja intelektualnog razvoja, poremećaja pokreta CNS-a u ljudi nakon 40 godina. Bolest je nasljedna i prenosi se autosomno dominantnim tipom, ima 100% penetranciju. Gen za bolest nalazi se u četvrtom kromosomu, u kratkom kraku.
Ovaj gen uključuje nukleotidnu sekvencu u obliku višestrukih ponavljanja CAG nukleotida. Kod zdravih ljudi, takva ponavljanja su normalno 11-34, bolesnici s korejom imaju 37-86, ali obično 45. Iz toga slijedi da je Huntingtonova koreja nasljedna patologija s mutacijom gena u višestrukom povećanju broja njegovih kopija (ekspanzija)..
Julia Viktorova, ginekolog-opstetričar