reproductology

Preimplantacijska dijagnoza (PGD) dijagnostika nasljednih bolesti i embrija

Genetsko testiranje je metoda koja se koristi za dijagnosticiranje nasljednih defekata u embrijima dobivenim oplodnjom in vitro prije trudnoće. Dijagnoza prije implantacije (PGD) alternativa je amniocentezi i biopsiji korionskih vilusa, koju često prati teška odluka o prekidu trudnoće ako su rezultati nepovoljni.. Danas je PGD jedina moguća opcija za izbjegavanje visokog rizika od dobivanja djeteta s genetskim bolestima..

 U kojim slučajevima se PGD izvodi u slučaju genetskih patologija

  • Indikacije za predimplantacijsku dijagnozu prema genetici:
  • Nositelj autosomno recesivnih bolesti;
  • Patologija povezana s X kromosomom;
  • Parovi sa značajnim kromosomskim translokacijama koje ometaju implantaciju, izazivaju pobačaje ili impliciraju mentalne ili fizičke probleme u potomstvu;
  • Nositelj autosomno dominantnih bolesti.

Dijagnoza prije implantacije koristi se za patologiju povezanu s spolom, defekte jednog gena i kromosomske poremećaje..

Zlostavljanja vezana uz spol

X-povezane bolesti prenose se djetetu preko majke koja je nositelj. Patološki X kromosom uzrokuje bolest kod sinova koji ne nasljeđuju normalan X kromosom od oca, već dobivaju Y kromosom. U budućnosti se očekuje rađanje zdravih dječaka, ali vjerojatnost prijevoza kćeri je 50%, pod uvjetom da je majčino zdravlje.

Važno je

Bolesti povezane s X kromosomom nikada se ne prenose s oca na sina.

Autosomna recesivna patologija uključuje hemofiliju, većinu neuromuskularnih distrofija i stotine drugih bolesti..

Autosomni dominantni poremećaji očitovat će se kao Rettov sindrom, pseudo-hiperparatiroidizam, rahitis otporan na vitamin D, Bloch-Sulzbergera sindrom (nasljedni poremećaj pigmentacije kože s patologijom vidnog aparata, zubi i središnji živčani sustav), itd..

Y kromosom nosi beznačajan broj gena, ali neke patologije seksualne diferencijacije su povezane s njom..

U teškim oblicima poremećaja spermatogeneze (kritično mali broj ili potpuni nedostatak muških zametnih stanica) u 18% slučajeva mikrodelecije se dijagnosticiraju u genu faktora azoospermije koji se nalazi na dugom kraku U kromosoma.

Oštećenja pojedinačnog gena

PGD ​​se koristi za identifikaciju pojedinačnih defekata gena koji uzrokuju brojne bolesti:

  • Cistična fibroza;
  • Bolest Thai Sachs;
  • Anemija srpastih stanica;
  • Huntingtonova bolest.

S tim patologijama, genetska dijagnoza otkriva defekt pomoću molekularnih metoda pomoću amplifikacije lančane reakcije polimeraze (PCR) (višestruka replikacija) DNA iz jedne stanice.

Kromosomski poremećaji

Translokacija, inverzija i brisanje rezultiraju oštećenjem kromosoma, koji se može detektirati upotrebom fluorescentne hibridizacije. Kod nekih parova, šanse za održivu trudnoću bez PGD-a su zanemarive, budući da su prethodni pokušaji doveli do pojave embrija s kromosomskom mutacijom i završili spontanim pobačajima..

Genetski skrining prije implantacije: relativne indikacije

Prema istraživanjima, većina ranih pobačaja u trudnoći uzrokovana je aneuploidijom, kršenjem broja kromosoma. Budući da se zdravi embriji prenose u maternicu, vjerojatnost pobačaja u prvom i drugom tromjesečju se smanjuje.

Trenutno ne postoji specifičan popis indikacija za PGD.

Genetski pregled prije implantacije smatra se poželjnim u sljedećim slučajevima:

  • Planirana trudnoća kod starije žene.
  • Opterećena opstetrijska i ginekološka povijest s ponovljenim pobačajima.
  • Neuspješni višestruki pokušaji IVF-a, uključujući ICSI metodu.
  • Teški faktor muške neplodnosti.

Dokazana činjenica da se rizik od aneuploidije povećava s dobi. Manje je vjerojatno da će kromosomi biti podijeljeni, što rezultira dodatnim ili odsutnim kromosomom u embriju. Patološki broj kromosoma je više od 20% za majke u dobi od 35 do 39 godina, a u dobi od 40 godina i starije 40%.

Učestalost aneuploidije u djece rođene od majki u dobi od 35-39 godina - 0,6-1,4%, starije od 39 godina - 1,6-10%.

Važno je

Ne završavaju sve trudnoće rođenjem održivog djeteta, ponekad se samo-prekid dogodi prije nego žena postane sumnjiva u svom stanju..

Primjer učestale aneuploidije je trisomija 21 kromosoma, koja dovodi do Down sindroma. Učestalost trisomije 21 u održivom fetusu procijenjena je ovisno o dobi majke. Prema rezultatima, optimalna dob za rađanje je od 20-24 godine (najmanji rizik je 1/1400). U dobi od 40 - 1/100, preko 45 godina - 1/25.

Ponovni pobačaj i PGD dijagnoza

Ako žena ima 2 ili više uzastopnih prekida trudnoće do 20 tjedana, PGD se opravdava prije IVF-a. Uzrok je često nepoznat, ali kromosomske abnormalnosti u pobačenim embrijima dijagnosticiraju se u 50-80%.

Obratite pozornost

Istraživanja su pokazala da su parovi s višestrukim pobačajima podložni većem postotku aneuploidnih embrija..

IVF nije uspio nekoliko puta zaredom

Tri ili više neuspjelih pokušaja IVF-a koji uključuju visokokvalitetne embrije mogu ukazivati ​​na kromosomske abnormalnosti. Osim toga, valja se sjetiti imunoloških i materičnih čimbenika koji pridonose narušenoj implantaciji..

Faktor muške neplodnosti

Muški hipogonadizam dovodi do stvaranja embrija s kromosomskim abnormalnostima. U normalnoj spermi prisutno je oko 3–8% oboljelih spermija. Njihov se broj značajno povećava kod muškaraca s teškom neplodnošću (smanjenje količine, loša morfologija i smanjena motorna aktivnost) na 27–74%.

Koristeći intracitoplazmatsku injekciju sperme u jajnu stanicu, loša kvaliteta sperme više nije prepreka za koncepciju biološki autohtonog djeteta. Utvrđeno je da su različiti genetski defekti povezani s muškim faktorom neplodnosti. Češće, to su aneuploidija, Klinefelterov sindrom, mikrodelecija Y kromosoma, oštećenje androgenog receptora i druge mutacije autosomnog gena (cistična fibroza)..

Važno je

Tijekom postupka ICSI, prirodna selekcija je isključena, pa se povećava rizik prijenosa genetskih mutacija na potomstvo.

Izbor spola

PGD ​​može odrediti spol embrija, ali želja za rađanjem dječaka ili djevojčice bez dokaza (genetske bolesti povezane s spolom) nije etički.

Usklađenost s antigenom ljudskog leukocita (HLA)

Među novim indikacijama PGD je HLA usporedba. Ova metoda može se koristiti za isključivanje genetske patologije. U situacijama gdje obitelj već ima dijete s recesivnom bolešću, a potrebno je liječenje matičnim stanicama ili transplantacijom koštane srži (talasemija, leukemija), Moguće je odabrati "odgovarajući" embrij, koji će nakon rođenja postati donator probanda (brat ili sestra). Prvi slučaj opisan je primjerom obitelji s djetetom oboljelom od Fanconijeve anemije, a PGD je proveden kako bi se odabrao zdravi zametak istog tipa HLA kao i bolesni brat.. Upotreba PGD-a u takvim situacijama je upitna iz moralnih i etičkih razloga..

Dijagnoza prije implantacije: kako se to radi i koji su načini

Parove u zoni rizika savjetuje genetičar koji procjenjuje rizik prijenosa genetske patologije. Provesti testove koji potvrđuju dijagnozu jednog od roditelja. Ovisno o genetskoj bolesti odabire se dijagnostička metoda kojom se mogu identificirati promjene u zametku..

Za dobivanje biomaterijala za PGD koristi se samo IVF.. Trećeg ili petog dana nakon oplodnje, ekstrahira se traženi biomaterijal. Genetska analiza prije presađivanja provodi se primjenom lančane reakcije polimeraze (PCR), fluorescentne hibridizacije (FISH), komparativne genomske hibridizacije (CGH) i NGS ispitivanja..

Zdrave zametke prenose se u maternicu (u pravilu ne više od 2), dok su ostatak vitrificirani. Brzo zamrzavanje omogućuje njihovo korištenje u sljedećim IVF ciklusima.

PCR

PCR se koristi za dijagnosticiranje pojedinačnih defekata gena, uključujući dominantne i recesivne poremećaje.. PCR (ponekad nazvan DNA amplifikacija) je metoda u kojoj se određeni slijed kopira mnogo puta, što omogućuje analizu.

Za točnu dijagnozu potreban vam je visokokvalitetni uzorak DNA koji je teško dobiti iz jedne stanice..

Pogreške u PCR analizi mogu dovesti do prijenosa slabije kvalitete embrija u 11% u autosomno dominantnu patologiju, au 2% u recesivnoj.

Lančana reakcija polimeraze omogućuje određivanje dijagnoze, ako postoji:

  • Defekti jednog gena u autosomalnoj bolesti;
  • Patologija pojedinačnog gena kod muške neplodnosti;
  • Rodna identifikacija za X-povezane bolesti.

Fluorescentna hibridizacija (FISH)

FISH se koristi za određivanje spola za X-povezane bolesti, kromosomske abnormalnosti i aneuploidiju.

Sonde koje predstavljaju male fragmente DNA koje odgovaraju analiziranim kromosomima vežu se za "svoj" kromosom. Svaka sonda ima vlastitu boju. Proces se vizualizira pod fluorescentnim mikroskopom. Broji se broj kromosoma svake boje i izvlače se zaključci..

Fluorescentna in situ hibridizacija je opravdana ako je potrebno izvršiti:

  • Aneuploidni probir kod žena starijih od 38-39 godina;
  • Brojanje broja kromosoma u muške neplodnosti;
  • Identifikacija spolova kod bolesti povezanih s X;
  • Dijagnoza roditeljskih translokacija koje su dovele do ponovljenih višestrukih pobačaja.

Usporedna genomska hibridizacija (CGH, SHG)

Ljudska stanica sadrži 23 para kromosoma; međutim, FISH analiza omogućuje točnu procjenu samo 7-9 kromosoma u svakoj dobivenoj stanici. Zbog toga mnogi abnormalni embriji ostaju neotkriveni i mogu se koristiti u prijenosu.

Kada se provodi komparativna genomska hibridizacija, test DNA se tretira fluorescentnom bojom (zelena), a crvena se koristi za uzorak. Potom se dvije stanice hibridiziraju i uspoređuje se omjer između dvije boje. Ako analiza kromosoma pokazuje višak crvene boje, embrionalna jezgra sadrži dodatni kromosom. Ako postoji višak zelene boje, onda jedan od kromosoma nedostaje u jezgri embrija.. SHS omogućuje ne samo ocjenjivanje svih 23 kromosoma, nego i detaljniju sliku duljine koja može otkriti neuravnoteženost segmenata kromosoma.

Ova metoda trenutno traje 72 sata. S obzirom na ograničeni životni vijek embrija u mediju za kulturu, potrebno je vitrifikaciju embrija. Čak i kod visokog preživljavanja, krioprezervacija može dovesti do 30% gubitka živih zametaka.. 

Obratite pozornost

U velikim reproduktivnim klinikama već rade na ubrzanim SHG protokolima, gdje rezultat postaje poznat nakon 24 sata, što omogućuje da ne propustite optimalno vrijeme za prijenos.

NGS testiranje

Metoda uključuje određivanje slijeda nukleotida (osnovnih struktura nasljednog materijala) u RNA i DNA.

Prednosti uključuju:

  • sposobnost procjene korisnosti / nedostataka svih kromosoma;
  • minimiziranje pogrešaka zbog automatizacije procesa;
  • simultano dekodiranje višestrukih sekvenci;
  • ponovljena analiza lokusa genetskog koda;
  • visoka osjetljivost i točnost;
  • minimiziranje pogrešnog zaključka (0,001%);
  • atraumatski za embrij;
  • povećati šanse za uspješan IVF.

Apsolutne indikacije za NGS: prijenos kromosomskih abnormalnosti u roditelja ili rodova, genetske bolesti povezane s spolom.

Studija prije implantacije NGS obuhvaća sljedeće korake:

  • biopsija embrija u stadiju blastocista, češće biopsija trofektoderma;
  • izolacija molekula nukleinske kiseline;
  • stvaranje osnova za naknadno genetsko testiranje,
  • pojačanje za dobivanje amplikona PCR metodom, koje se uzimaju kao uzorak;
  • kompjutorizirana vizualizacija primarnog DNA / RNA modela kao rezultat višestruke, neparalelne analize fragmenata.

Stručnjak procjenjuje na računalnoj grafici, koja pokazuje patologiju u obliku padova ili vrhova.

Na temelju NGS testiranja, embriji s niskom vitalnošću ili s klinički izraženim mutacijama se odbacuju, a ostatak nakon odmrzavanja koristi se u IVF protokolima.

Ne obavljaju sve analize klinike za reprodukciju..

Važno je

Dijagnoza prije implantacije nije uključena u popis usluga za obvezno zdravstveno osiguranje i plaća ga pacijent.

Što se istražuje s PGD-om

Većina klinika izvodi biopsiju embrija u fazi cijepanja, ali jedna od 3 metode može se koristiti za PGD.

Biopsija polarnog tijela

Metoda je prikladna za otkrivanje genetske patologije kod žene, budući da je procijenjen broj kromosoma u jajnoj stanici. Biopsija polarnog tijela ne dopušta dobivanje informacija o kromosomskoj strukturi budućeg embrija, jer će dobiti drugu polovicu genetskog materijala od oca. Ova metoda se rijetko koristi..

Biopsija embrija s hetchingom

Najčešća metoda PGD-a je proučavanje jednog blastomera dobivenog iz razvoja embrija trećeg dana. Uzimanje blastomera tehnički je zahtjevan postupak, a provodi se pomoću posebnog mikroskopa i mikromanipulatora. Cilj - uklanjanje željenih stanica uz minimalnu traumu embrija.

Trećeg dana razvoja embrij se sastoji od 6-10 stanica, a prije manipulacije čuva se u posebnom okruženju 20 minuta kako bi se smanjilo ljepljenje blastomera. Zatim je zametak fiksiran i unutar zona pellucida nastaje rupa koja otvara pristup blastomerima. Ovaj se postupak naziva "izleganjem" i može se izvesti pomoću otopine kiseline, lasera ili mehanički. U rupu se umetne pipeta koja se fokusira na odabrani blastomer s vidljivom jezgrom. Aspiracijom se blastomeri ekstrahiraju i obrađuju za FISH ili PCR (PCR dijagnoza), ovisno o genetskoj patologiji. Embrio je uronjen u odgovarajući medij za kulturu..  

Nedostaci metode uključuju činjenicu da embrij može biti mozaik, a za genetsku analizu postoji vjerojatnost uklanjanja "zdravog" blastomera.

Biopsija blastocista

Formiranje blastociste započinje petog dana i određuje se akumulacijom unutarnje i vanjske masa stanica. U ovoj fazi, embrij se sastoji od oko 100 stanica. Kroz rupu, stanice se uzimaju iz trofektoderma pomoću tanke pipete za biopsiju. Unutarnja stanična masa nije ozlijeđena. Genetska analiza se izvodi pomoću FISH ili PCR.

Ograničenje dijagnostičkog postupka - mozaik embrija i vrijeme potrebno za studij - 24-48 sati, što značajno smanjuje vitalnost i ometa implantaciju.

Jedini izlaz je zamrzavanje biomaterijala, nakon čega kvaliteta embrija malo pati.

PGD ​​se u većini slučajeva završava unutar 24 sata nakon izvođenja biopsije, što vam omogućuje da izvršite transfer 4. ili 5. dan.

Obratite pozornost

Većina klinika analizira 24 kromosoma (22 autosoma i 2 spolna kromosoma) primjenjujući komparativnu genomsku hibridizaciju nakon što embrij dosegne 5 dana starosti..

Za i protiv genetske analize u trodnevnim i 5-dnevnim embrijima

Tri dana:

  • veći rizik od ozljeda (oko 15%, važnu ulogu igra kvalifikacija embriologa);
  • sposobnost da se izvrši analiza na samo 9 kromosoma, uključujući samo najčešće nasljedne bolesti;
  • vjerojatnost biokemijskog i propuštenog pobačaja zbog patologije u neistraženim kromosomima;
  • mozaicizam.

Pet dana:

  • Smanjuje se sposobnost preživljavanja embrija koji postoje izvan tijela majke, potrebno je čekati da se izvrši biopsija (moguće je podvrgnuti ranoj blastocisti vitrifikaciji ili prijenosu);
  • zaustavljanje razvoja "dobrih" embrija koji nisu povezani s genetskim faktorima;
  • mogućnost provođenja sveobuhvatne kromosomske analize;
  • nizak rizik od oštećenja embrija (oko 5%).
Važno je

Zametci slabe kvalitete odbijaju se ako je njihov prijenos izvršen, ili se trudnoća nije pojavila ili završila u razvoju ili samo-prekidu u ranim fazama.

Koji je najbolji način za PGD

Stručnjaci vjeruju da je komparativna genomska hibridizacija bolja od

FISH-dijagnostika, budući da su mogućnosti metode šire, a rizik od ozljeda embrija je manji. S osobitostima kariotipa roditelja (na primjer, translokacija) postoji mogućnost spajanja interkromosomskog učinka - rizik od nepravilnog odstupanja od bilo kojeg kromosoma, a ne samo onih oštećenih i dijagnosticiranih tijekom kariotipiranja kod majke ili oca..

Nedostaci uključuju potrebu za krioprezervacijom i visokim troškovima.

Studija FISH je bolja od PCR, budući da reakcija polimeraze nosi rizik pogrešne dijagnoze zbog biološke kontaminacije..

Danas najučinkovitija metoda - NGS - sekvenciranje nove generacije.

Mishina Victoria, urolog, liječnik